На прошлой неделе в Nature было опубликовано описание технологии, которая способна радикально ускорить исследования мозга. Ученые научились делать мозг прозрачным, что позволяет разглядеть в микроскоп отдельные нейроны и их связи между собой. Метод не требует изготовления срезов, а клетки разных типов в нервной ткани светятся разными цветами. «Лента.ру» попыталась разобраться, что же означает появление такого метода для современной науки о мозге.
«Мозг — это мир, состоящий из множества неоткрытых континентов и огромных неизведанных пространств», — такую надпись можно прочитать на дне сосуда, фотография которого опубликована в последнем номере Nature. Замечателен, конечно, не сам трюизм, а тот факт, что, читая эту надпись, мы не замечаем цельного мозга мыши, лежащего поверх нее в сосуде. Нейробиологам из Стенфорда удалось сделать нервную ткань грызуна совершенно прозрачной, и в этом прозрачном мозге при помощи обычного светового микроскопа можно рассмотреть отдельные нейроны, светящиеся в темноте желтым, красным и синим флюоресцентным светом.
Фотографии и видеозаписи, приложенные авторами к публикации, производят достаточно сильное впечатление. На них можно ясно рассмотреть отдельные нейроны, их тела, форму клеточных отростков и другие элементы анатомии, известные по классическим рисункам Рамона-и-Кахаля, перекочевавшим в учебники биологии. При этом на рисунках классика отмечены отдельные, случайные клетки, а сами изображения сделаны на основе тончайших микроскопических срезов. Светящиеся же нейроны на фотографиях стенфордских ученых находятся в практически нетронутом мозге на своих собственных местах, и разными цветами светятся разные типы нервных клеток — потенциально любые клетки из тех, что интересуют исследователей, могут быть подсвечены особым образом.
Справедливости ради стоит сказать, что сделать нервную ткань прозрачной ученые пытаются уже около десятка лет, и группа из Стенфорда была в этих исследованиях далеко не первой. Значительных результатов в этом направлении удалось достичь еще в 2007 году.
Стремление к прозрачности
Мозг, как известно, имеет серовато-белый цвет. Этот цвет возникает в результате множественного отражения света на границах клеточных мембран, и в этом смысле мозг мало чем отличается от, скажем, молока, где свет отражают мицеллы жира.
Чтобы сделать нервную ткань прозрачной, отражение нужно свести к минимуму. Достичь этого ученые сперва пытались при помощи растворов органических веществ со специально подобранным коэффициентом преломления — таким, чтобы на границе клеточной мембраны отражения не происходило. Использование таких растворов позволило сделать нервные срезы прозрачными, но метод все же имеет существенные недостатки. Например, использование таких веществ подавляет флюоресценцию, а без нее осветление мозга теряет всякий смысл, поскольку именно флюоресцентные красители позволяют пометить те или иные клетки в ткани.
Альтернативным способом просветления мозга может быть полное удаление у клеток мембран. До сих пор столь радикальный метод никто всерьез не рассматривал, так как в норме такое удаление приведет к превращению мозга в неструктурированную «кашу». Тем не менее ученые из Стенфорда пошли именно этим путем, и в ходе работы им удалось сохранить практически нетронутой структуру нервной ткани и подавляющее большинство клеточных белков.
Секрет ученых заключается в использовании специального матрикса, который, с одной стороны, поддерживает все структуры на своих местах, а с другой — не препятствует диффузии таких достаточно крупных молекул, как флюоресцентные антитела.
В соответствии с разработанной учеными технологией мозг мыши насыщают тремя веществами-сшивателями: формальдегидом, акриламидом, бисакриламидом, а также соединением, которое при нагревании инициирует полимеризацию. Во время полимеризации акриламид и бисакриламид образуют прозрачную полимерную сетку, а формальдегид пришивает к ней белки и нуклеиновые кислоты нервной ткани.
Важно, что при этом липиды, из которых состоят мембраны, оказываются никак не соединены с полимерной матрицей, поэтому их можно легко удалить с помощью обычных поверхностно-активных веществ. Вся процедура занимает три дня, после чего препарат можно опустить в раствор красителей — флюоресцентных антител. Спустя еще неделю ученые получают прозрачный мозг, в котором при облучении возбуждающим светом разными цветами начинают светиться, например, клетки глии, возбуждающие и тормозящие нейроны.
Ученые испытали новую технологию не только на мозге мышей, но и на срезах человеческого мозга, традиционно хранящихся в формалине. Как оказалось, формальдегид совершенно не мешает процедуре просветления, так что ее можно будет провести на огромных коллекциях препаратов, хранящихся в лабораториях по всему миру.
Сделать прозрачным мозг человека целиком пока невозможно — он слишком большой. Работать приходится с отдельными срезами, однако толщина этих срезов измеряется уже миллиметрами, а не микрометрами, как в классической микроскопии. Впрочем, даже если бы человеческий мозг можно было бы сделать прозрачным целиком, это было бы практически бессмысленно: на нем невозможно было бы работать с микроскопом, глубина «проникновения» которого не превышает сантиметра.
Важно, что новый метод не только позволяет подсветить в препарате отдельные клетки в соответствии с их особыми свойствами (например, только те, которые синтезируют белки, связанные с памятью), но и менять эти маркеры. Один и тот же препарат — например, мозг мыши, которая прошла специальное обучение в эксперименте и нейроны которой содержат отпечаток такого обучения, — можно свободно перекрашивать различными маркерами по несколько раз. Ученые даже предложили собрать подобные препараты в особые библиотеки для изучения разными группами исследователей.
Ограничения нового метода очевидны — он позволяет изучать только мертвый мозг. Ни о какой активности нейронов в препарате, зафиксированном формалином и акриламидом, речи быть не может. Конечно, в последнее время нейробиологи научились по синтезу особых РНК «вылавливать» те нейроны, которые работали непосредственно (за минуты) перед тем, как животное превратили в препарат, однако это не делает такое ограничение менее серьезным.
На службе коннектома
Область нейробиологии, для которой метод создания прозрачного мозга будет иметь наибольшее значение, называют коннектомикой, по аналогии с отраслью изучения геномов — геномикой. Коннектомом называют совокупность всех связей между нейронами, число которых в мозге человека оценивается в квадриллион штук (1015).
Модель структуры микроскопического участка нервной ткани, построенная на основе реконструкции срезов. Разными цветами показаны отростки разных нейронов.
TED/Sebastian Seung
Создание полной модели связей всех нейронов в мозге выглядит сейчас настолько же амбициозной и трудоемкой задачей, какой когда-то было определение последовательности ДНК в проекте «Геном человека». С одной стороны, у ученых уже есть успешный опыт в составлении самых примитивных коннектомов — еще в 1986 году удалось установить семь сотен связей между 302 нейронами в червяке Caenorhabditis elegans. С другой стороны, квадриллион синапсов человеческого мозга выглядит пока недоступной и фантастической цифрой. Впрочем, и секвенирование человеческого генома двадцать лет назад было такой же фантастикой.
В настоящее время есть два подхода к составлению коннектома, их можно условно обозначить как метод «сверху вниз» и «снизу вверх». Оба подхода имеют свои слабости, однако есть основания полагать, что новая методика «осветления» мозга может стать их связующим звеном.
Метод составления коннектома «снизу вверх» подразумевает нарезание маленького фрагмента нервной ткани на тысячи тонких слоев, их электронную микроскопию, распознавание отдельных клеток и синапсов на полученных микрофотографиях и в конце концов реконструкцию трехмерной модели данного участка мозга. Это очень сложная и кропотливая работа. Метод дает исчерпывающую структурную информацию о нервной ткани, однако применить его можно только к исключительно маленьким — микроскопическим фрагментам нервной ткани. Составление полного коннектома даже крохотной плодовой мушки дрозофилы таким методом пока невозможно, не говоря уже о мозге человека.
Альтернативный подход «сверху вниз» подразумевает составление карты связей именно в мозге людей, причем разных людей — в том числе и страдающих психическими заболеваниями. Этот подход использует так называемый метод диффузной магнитно-резонансной томографии и внешне мало отличается от обычной МРТ, которую можно легко и безболезненно проводить на людях.
Принцип метода заключается в том, чтобы при помощи томографа для каждой точки мозга определить направления, в которых вода движется плохо, то есть измерить анизотропию ее диффузии. В нервной ткани такая анизотропия возникает в непосредственной близости от аксонов — тяжей нейронов, которые образуют белое вещество. Белое вещество составляют магистрали мозга, связывающие его отдаленные части. Вода внутри белого вещества лучше двигается вдоль тяжей аксонов, и это можно увидеть на данных томографа.
Трехмерная модель связей в мозге, составленная по данным диффузионной МРТ.
Иллюстрация: humanconnectomeproject.org
Понятно, что метод диффузной МРТ дает только общую информацию о связях в мозге и неприменим для изучения коры, серого вещества, где образуется большинство синапсов. Этот метод вообще «видит» только направления, а не отдельные нейроны, не говоря уже об их микроскопических контактах. И формально, если термином «коннектом» обозначается совокупность связей между клетками, то МРТ неспособен его исследовать. Отсюда возникает некоторая путаница, так как главный исследовательский проект, в котором применяется технология диффузной МРТ, — это как раз созданный Национальными институтами здоровья США проект «Коннектом человека» (Human Connectome Project).
Два подхода, каждый со своими ограничениями, позволяют изучать структуру мозга на микро- и макроуровне. Технология просветления нервной ткани может выступить здесь связующим звеном и заполнить промежуток между ними. С одной стороны, она позволяет получать достаточно детальные изображения, на которых можно разглядеть отдельные синапсы, с другой стороны, при желании с ее помощью можно увидеть каждый нейрон целиком, даже если его отростки идут из одного конца мозга к другому.
Вместо заключения
В начале апреля этого года Барак Обама официально объявил о старте исследовательской программы BRAIN, самой амбициозной из всех научных инициатив с момента завершения проекта «Геном человека». В рамках этой программы будут координироваться исследования коннектома, проводимые множеством разных американских институтов. Стоимость программы за десять лет должна составить три миллиарда долларов.
За пару месяцев до этого проект сравнимого масштаба Blue Brain запустил Европейский союз. Он будет посвящен созданию «виртуального мозга» — моделированию при помощи суперкомпьютеров активности отдельных нейронов, их ансамблей и в будущем всего мозга целиком. Судя по текущему информационному фону, кажется, в нейробиологии складывается действительно «предреволюционная» ситуация.